A. DNA模板：

·   盡量使用高質(zhì)量、純化后的DNA作為模板

·   需要提高保真度時(shí)，可使用較高的DNA模板濃度并減少循環(huán)數(shù)

·   模板用量：以50 μl反應(yīng)體系為例——

        人基因組DNA：0.1~1.0 μg

        大腸桿菌基因組DNA：10~100 ng

        Lambda DNA：0.5~5 ng

        質(zhì)粒或病毒DNA：0.1~10 ng

B. 引物設(shè)計(jì)原則：

·  引物長度要滿足特異性需要，一般可在18~25個(gè)堿基之間；擴(kuò)增長片段時(shí)在24~30個(gè)堿基之間；

·  當(dāng)引入克隆位點(diǎn)時(shí)，引物末端應(yīng)額外增加3個(gè)以上堿基；

·  (G+C)%含量應(yīng)盡量控制在40~60%，兩條引物的(G+C)%含量應(yīng)盡量接近；

·  引物中GC堿基分布均勻；

·  盡量避免相同堿基連續(xù)出現(xiàn)三次以上，3’端應(yīng)避免使用A或T；

·  避免引物內(nèi)部自身配對(duì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；

·  正反向引物之間應(yīng)避免配對(duì)堿基，尤其是3’端的三個(gè)堿基，否則易生成引物二聚體(Primer dimer)；

·  兩條引物的解鏈溫度（Tm）值應(yīng)在42~65℃之間，而且兩條引物間相差不超過5℃；

·  引物Tm值的計(jì)算方法：

       20 nt以下：Tm = 2℃ x (A + T) + 4℃ x (G + C)

       20 nt以上：Tm = 81.5 + 0.41 x (GC%) -600/nt (nt：引物的堿基數(shù))

·  引物用量：

·  0.1~1.0 μM，通?？梢?.2 μM起始，根據(jù)體系不同調(diào)整用量；

·  使用簡并引物、隨機(jī)引物時(shí)，需增加引物總量以彌補(bǔ)產(chǎn)量損失；但隨著引物量加大，特異性將降低；

·  模板較大較多，或結(jié)構(gòu)較復(fù)雜(如人基因組DNA)時(shí)，需減少引物用量以提高特異性；

·  模板較小較少(如質(zhì)粒模板)時(shí)，增加引物用量可提高產(chǎn)量。

C. 核苷酸（dNTPs）：

·  常規(guī)dNTPs濃度為每種核苷酸0.1~1.0 mM，通?？梢?.2 mM起始，根據(jù)體系不同調(diào)整用量；

·  低濃度（0.05~0.1 mM）可增加保真性，但會(huì)降低產(chǎn)量；

·  高濃度提高產(chǎn)量，尤其是長片段PCR，但會(huì)降低保真度。

D. 鎂離子濃度

·   對(duì)于Taq DNA聚合酶，鎂離子的*濃度為1.5~2.0 mM；

·   *濃度取決于模板、緩沖液、DNA和dNTPs（每一種都有可能鰲合鎂離子）；

·   鎂離子濃度過低，會(huì)降低產(chǎn)量；

·   鎂離子濃度過高，會(huì)增加非特異性PCR產(chǎn)物；

·   優(yōu)化鎂離子濃度時(shí)，通常以0.5 mM梯度遞增，zui高到4 mM。

E. Taq DNA 聚合酶濃度

·   推薦使用濃度為 1~2.5 U/50 μl反應(yīng)體系。

F. 起始反應(yīng)

·   在冰上配制反應(yīng)體系；

·   zui后加聚合酶；

·   將熱循環(huán)儀預(yù)熱至變性溫度(94℃)后，放入PCR管，立即進(jìn)行反應(yīng)。

G. 變性溫度與時(shí)間

·   通常于94℃初始變性，使DNA雙鏈*打開；

·   變性時(shí)間通常為15~30秒；

·   避免長時(shí)間或高溫度孵育；

·   高GC含量模板可提高變性溫度至98℃。

H. 退火溫度與時(shí)間

·   通常情況下，退火溫度為引物Tm值減5℃，在55~60℃之間；

·   提高退火溫度有利于減少非特異性條帶；

·   常規(guī)退火時(shí)間為15~30秒。

I. 延伸溫度與時(shí)間

·   延伸反應(yīng)通常在72℃下進(jìn)行。

·   Taq酶的延伸時(shí)間大約為15~30秒/kb DNA；

·    產(chǎn)物小于1 kb時(shí)，建議延伸時(shí)間為30~60秒；

·    產(chǎn)物大于3 kb或反應(yīng)超過30個(gè)循環(huán)時(shí)，可能需要更長的延伸時(shí)間。

典型的循環(huán)條件：

預(yù)變形94℃ 2 分鐘

94℃ 30秒，

55℃ 30秒，

72℃ 1分鐘/1 kb，25~30個(gè)循環(huán)

72℃ 5分鐘

注：上述反應(yīng)條件適用于普通Taq DNA聚合酶催化的PCR反應(yīng)。當(dāng)DNA模板富含GC、具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)、低濃度或產(chǎn)物>5 kb時(shí)可能需要改變相應(yīng)條件。